基于中医“肾阳虚证”蛋白差异表达分析的虚拟仿真实验是以“强化基础理论、突出中医特色、创新思维训练”为导向，以中医证候的基础研究为主干、蛋白免疫印迹技术为支撑的多学科融合性实验项目。

一、目的要求

（一）知识目标

             1.能归纳中医证候生物学基础研究的具体要素：研究假说建立、研究因素挖掘、研究对象及生物学指标选择等；

             2.能解释SOD1差异表达与肾阳虚证的相关性，结合文献分析SOD1含量的变化对于衰老进程、老年性疾病预后的影响；

             3.能解释蛋白印迹技术的基本原理；

             4.能运用实验结果解释研究假说：血细胞SOD1的差异表达是老龄肾阳虚证的生物学内涵。

             5.能综合运用中医诊断学、生物化学、分子生物学、免疫学等多学科知识，理解实验方案设计的原则、思路和实验技术核心内容，为中医药研究奠定基础。

（二）能力目标

            1.能建立中医证候研究的思维框架，学有余力的学生能参与中医证候量表的顶层设计或优化，逐步学会临床研究方案的制定；

            2.能通过绘制流程图等方式规划实验流程；

            3.能独立配制实验用试剂，操作实验设备，掌握主要试剂的作用，相关设备的功能和使用方法，提升实验技能；

            4.能正确记录并分析实验数据，完成实验报告撰写，实验成果如实验报告、翻转课堂能体现对实验过程和实验设计的思考，并能提出中医证候生物学基础研究存在的主要问题及改进方法。

            5.通过小组讨论、翻转课堂等提升表达和沟通能力。

（三）素质目标

            1.通过模拟中医学、生物化学、分子生物学、免疫学等多学科融合的综合性实验场景，激发学生对中医学习、研究的兴趣和热情；

            2.能建立发现问题、分析问题、解决问题的科学思维；

            3.能建立对于患者、老龄人群的共情和关怀；

            4.通过小组讨论等线下学习模式进行生生互动或师生互动，树立团队协作意识。

二、实验原理

（一）实验对象选择依据

    实验者在虚拟诊室进行病例采集，根据各案例的四诊信息进行证素辨证，按纳入标准选择虚拟实验对象：①老龄肾阳虚组（aging kidney-yang dificiency，AD）、②老龄健康组（aging control，AC）。

（二）基于iTRAQ/TMT技术分析老龄肾阳虚证外周血细胞差异蛋白

    实验者进入虚拟实验室，采用基于iTRAQiTRAQ/TMT技术的蛋白组学分析AD（老龄肾阳虚组）和AC（老龄健康组）外周血细胞蛋白表达差异，探索肾虚发生发展过程中可能的生物标志物，获取SOD1的差异表达信息。

（三）采用蛋白印迹技术检测外周血细胞SOD1含量

    采用蛋白免疫印迹检测两组患者外周血细胞SOD1，以β-actin为内参照，通过扫描分析着色条带的灰度值获取SOD1相对定量，进而对老龄肾阳虚组SOD1蛋白表达差异进行验证。

三、虚拟器材和试剂

（一）虚拟器材

    真空采血管（EDTA抗凝）、1.5mL尖底离心管、15mL刻度离心管、单通道可调量程移液器、盒装吸头、NUNC冰盒、BIORAD电泳槽、BIORAD基础电泳仪164-5050、制胶板、制胶架、转印夹板、转印电泳槽、PVDF膜、脱色摇床、凝胶成像系统

（二）虚拟试剂（配制方法见实验指导第三篇，实验七）

    含1mM PMSF的细胞裂解液、内参蛋白β-actin、15%分离胶、5%浓缩胶、上样缓冲液（加溴酚蓝）、1×电泳缓冲液 pH8.6、1×转膜缓冲液、兔抗人SOD1、β-actin第一抗体（1：5000）、羊抗兔第二抗体（1：10000）、封闭液、TBST 、TBS、ECL化学发光试剂盒

四、实验方法

（一）证素辨证法

    采集虚拟对象的四诊信息，识别证素，判断证名。

（二）对照法

    空白对照与实验对照的设置，如老龄肾阳虚证和老龄健康者的外周血细胞蛋白差异表达比较。

（三）定量分析法

    外周血细胞总蛋白的提取和定量，凝胶电泳分析等。

（四）观察法

    内参蛋白、目的蛋白条带的观察及现象总结。

（五）推理归纳法

    根据实验现象和实验数据推理得出规律和结论。

（六）统计分析法

    对SOD1相对表达量的差异表达进行统计分析，使用软件作图呈现分析结果。